Исследователи сообщили о применении генетически модифицированных стволовых клеток для формирования новых мышечных волокон и улучшения мышечной функции в мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна (МДД)

Команда из Италии, руководимая учеными из Milan’s San Raffaele Scientific Institute, вначале изолировала из кровеносных сосудов стволовые клетки, именуемые мезоангиобластами, у mdx-мышей с отсутствующим мышиным геном дистрофина. Затем генетический дефект был скорректирован с использованием человеческой искусственной хромосомы (human artificial chromosome - HAC), содержащей полноразмерный ген человеческого дистрофина (DYS-HAC), после чего содержащие DYS-HAC мезоангиобласты были введены подвергшимся иммуносуппрессии животным.

Было установлено, что трансплантированные клетки размножились и дифференцировались в мышечные клетки, и экспрессировали человеческий ген дистрофина. В результате в последующие несколько месяцев животные продемонстрировали как морфологические, так и функциональные улучшения. Эти результаты были опубликованы Giulio Gossu, M.D. и Francesco Saverio Tedesco, M.D. с коллегами в журнале Science Translational Medicine в статье “Stem Cell-Mediated Transfer of a Human Artificial Chromosome Ameliorates Muscular Dystrophy.”

Генотерапевтические подходы в лечении МДД сложны для осуществления, поскольку ген дистрофина слишком велик, чтобы быть упакованным в вирусный вектор для доставки. Поэтому основное развитие получили платформы, основанные на мини- и микродистрофине, а также методика пропуска экзонов

Примененная исследователями из San Rafaelle стратегия построена на двух технологиях, разработанных Dr. Gossu и его командой. Во-первых, в последнее время исследователи сообщали об изоляции и описании связанных с кровеносными сосудами стволовых клеток - мезоангиобластов, и продемонстрировали, что эти клетки могут дифференцироваться в несколько типов стволовых клеток мезодермы в скелетных мышцах.

Важно, что будучи введенными в кровоток, мезоангиобласты могут проходить через стенки кровеносных сосудов и участвовать в регенерации скелетных мышц. Как утверждают ученые, ранее было показано, что эти клетки способны даже улучшать симптомы мышечной дистрофии в собачьей модели заболевания. В действительности, донорские (HLA)-совместимые мезоангиобласты были размножены в условиях клинического класса и в настоящее время вводятся МДД пациентам в клиническом исследовании фазы I/II при институте (San Rafaelle)

Вторая технология основана на использовании HAC, в частности, ученые разрабатывают HAC-вектор, содержащий полноразмерный человеческий ген дистрофина. Предварительные исследования показали, что DYS-HAC конструкция способна корректировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), выделенные у пациентов с МДД

Теперь команда Dr. Gossu скомбинировала обе платформы для развития разработанной клеточной методики для лечения МДД. В первой серии экспериментов in vivo они изолировали мезоангиобласты у mdx-мышей, размножили их и модифицировали с помощью содержащей дистрофин HAC. HAC дополнительно были снабжены EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein - зеленый флуоресцентный белок) маркером для облегчения визуализации и перенесены с белком MyoD (белок, играющий ключевую роль в регуляции мышечной дифференциации), дабы способствовать их дифференциации в скелетные мышцы после трансплантации. Как отмечают авторы, трансдукция с MyoD также устраняет вариабельность спонтанной миогенной активности, наблюдаемой среди различных популяций мезоангиобластов, не подавляя при этом пролиферацию и миграцию клеток

Полученные "сконструированные" мезоангиобласты с геном дистрофина были внутримышечно инъецированы 4-месячным SCID/mdx мышам (SCID - иммунодефицит) Томографическое исследование показало, что в инъецированных мышцах DYS-HAC-скорректированные мезоангиобласты широко распространены, а анализ RT-PCR обработанных мышей продемонстрировал экспрессию мышечно-специфического человеческого дистрофина

Иммуногистохимический и вестерн-блот анализы трасплантированной ткани подтвердили реконструкцию дистрофин-протеинового комплекса. Гистологические и биохимические анализы инъецированных мезоангиобластами мышц показали улучшение морфологических признаков дистрофического фенотипа, при этом уменьшилась инфильтрация мышц мононуклеарными клетками, и снизилась выраженность воспалительных факторов.

Примечательно, добавляют авторы, что трансплантированные мышцы производили 25% от количества дистрофина, производимого мышцами здоровых контрольных мышей, а измерение поперечного сечения скелетных мышц обработанных мышей в сравнении с необработанными SCID/mdx и SCID контрольными мышами показало частичную нормализацию у обработанных дистрофических животных

Ученые изучили DYS-HAC-скорректированные mdx мезоангиобласты с точки зрения долгосрочной стабильности DYS-HAC вектора и правильности экспрессии дистрофина in vitro и in vivo. Как FISH, так и PCR анализ подтвердили, что HAC вектор не интегрировался в геном хозяина и содержал корректные серии последовательностей гена человеческого дистрофина после более чем 30 делений in vitro и после 8 месяцев in vivo. RT-PCR показал корректную ткане-специфическую экспрессию гена человеческого дистрофина

Поскольку мезоангиобласты имеют способность проходить через стенки сосудов после их внутриартериального введения, исследователи инъецировали MyoD-экспрессирующие DYS-HAC–скорректированные mdx мезоангиобласты в бедренную артерию SCID/mdx мышей. Некоторое количество клеток были обнаружимы в миофибриллах уже в первые 12 часов, а по прошествии 36 часов имелись четкие свидетельства того, что трансплантированные клетки были равномерно распределены в мышцах. Три недели спустя кластеры дистрофин- и EGFP-положительных волокон были явными, а специфические для скелетных мышц транскрипт дистрофина и сам дистрофин обнаруживались примерно на уровне 18% от уровней у контрольных животных

У обработанных SCID/mdx мышей дополнительно отмечалось ослабление интенсивности гистологических изменений в скелетных мышцах. «Эти результаты демонстрируют способность скорректированных mdx мезоангиобластов активно участвовать в мышечной регенерации, проникая через стенки сосудов после внутриартериальной инъекции» - пишут авторы

Чтобы оценить, сопровождались ли фенотипические изменения мышц функциональными изменениями в результате терапии DYS-HAC-скорретированными mdx мезоангиобластами, исследователи измеряли моторные возможности, хрупкость миофибрилл и удельное усилие у обработанных и необработанных SCID/mdx животных. Обнадеживающим было то, что обработанные мыши как после внутримышечных, так и после внутриартериалных инъекций показали существенное улучшение мышечной силы и моторной способности по сравнению с контрольными SCID/mdx мышами, и этот положительный эффект оставался явным в течение нескольких месяцев.

Более того, мышечные волокна обработанных животных в гораздо меньшей степени окрашивались красителем Эванса голубого (Evans blue dye — EBD). ”EGFP-положительные волокна всегда были неокрашенными EBD, показывая, что экспрессия дистрофина из DYS-HAC вектора предотвращает хрупкость мембран и сопутствующую проницаемость этого красителя» - констатируют иcследователи

В завершение, а также для проверки терапевтической эффективности в более тяжелой дистрофической модели, исследователи трансплантировали скорректированные mdx мезоангиобласты Sgca-null (с отсутствием гена альфа-саркогликана) мышам с подавленным иммунитетом, у которых с возрастом развивается прогрессирующая мышечная дистрофия и некроз мышц. Эти животные после обработки продемонстрировали схожее улучшение моторной способности и сниженное поглощение красителя EBD.

Общие результаты «предоставляют доказательства для эффективной клеточно-генной заместительной терапии с использованием HAC у дистрофических мышей» - заключают ученые. «Трансплантация SCID/mdx мышам скорректированных mdx мезоангиобластов снижает хрупкость миофибрилл и усиливает переносимость физической нагрузки более чем на 50%. Внутримышечная трансплантация приводит к тому, что около 10% миофибрилл становятся дистрофин-положительными, что в свою очередь приводит к синтезу дистрофина на уровне 20% от синтезируемого у SCID-мышей дикого типа, что вероятно может отражать повышенный синтез дистрофина в ядрах донорских клеток»

Исследователи отмечают, что при внутриартериальном введении аналогичной по эффективности дозой является инъекция 106 клеток. В совокупности все эти данные согласуются с сообщениями, показывающими, что синтез дистрофина на уровне примерно 30% от нормы предотвращает мышечную дистрофию как у мышей, так и у людей.

Исследователи обращают внимание, что хотя эти исследования проводились на мышах с подавленным иммунитетом, в клинических условиях иммуносуппрессия может и не потребоваться, особенно если новое поколение разработанных DYS-HAC векторов не будет содержать каких либо иммуногенных трансгенов, таких как EGFP. Другими преимуществами разработанного подхода использования мезоангиобластов являются его потенциальная применимость для всех пациентов с МДД независимо от типа мутации; наличие полноразмерного локуса дистрофинового гена, и, следовательно, осуществление корректной экспрессии различных его транскриптов; улучшенная безопасность вследствие эписомальной природы HAC, которая не интегрируется в хромосомы клетки-хозяина

Авторы признают, что существуют некоторые как технические, так и регуляторные сложности, которые надо будет преодолеть до того, как это направление сможет дойти до клинического применения. В частности, человеческие мезоангиобласты потребуют дополнительных шагов по расширению их пролиферативной способности, а также их гарантированному избирательному выживанию после трансфекции HAC. С этой целью, говорят ученые, они разрабатывают платформу для создаваемых мезоангиобластов МДД пациентов, содержащую подлежащие удалению лентивирусные вектора, экспрессирующие «бессмертные» гены

miopatia.ru